1、超临界CO2流体技术制备纳豆激酶口服制剂的研究

作为具有活性的生物大分子,NK直接口服的生物利用度不高。NK在pH6~12,50℃以下时均较稳定；具有抗胃蛋白酶及胰蛋白酶性能,但对酸性环境敏感；因此要提高NK口服后的生物利用度,最重要的是防止胃酸环境的破坏,同时防止肠消化酶的降解,促进NK在回肠后段及结肠部位靶向吸收利用超临界C02流体技术以酸性环境敏感的肠溶材料Eudragit(？)L100-55对NK的载药微丸进行包衣制成包衣微丸,对包衣微丸的抗酸能力及释放行为进行了考察,并最终完成了药效学及生物利用度的研究。主要研究：1.r-NK摇瓶发酵表达,纯化,冻干。2.优化超临界C02流体技术包衣工艺,并制备r-NK包衣微丸。3.制备r-NK兔源多克隆抗体。4.探索r-NK包衣微丸药效学和生物利用度研究方法,并最终完成药包衣微丸的药效学及生物利

2、花生粕固态发酵制备纳豆激酶和生物活性肽的工艺研究

利用纳豆芽孢杆菌固态发酵花生粕,制备纳豆激酶(NK)、抗氧化活性物质、血管紧张素转换酶抑制肽(ACE抑制肽),为高值化利用花生粕提供理论和实践依据。论文共分为以下四个部分:1、纳豆芽孢杆菌固态发酵花生粕制备NK的工艺探究。以NK活力为指标,通过单因素和正交试验优化NK的制备工艺。NK的最佳发酵条件:温度37℃,发酵24 h,接种量10%,料水比1:0.4。在此条件下测得发酵产物NK活力为3162 U/m L,比单因素试验的最高活力提高18%(2680 U/m L),可溶性氮含量5.6 mg/m L。2、NK冷冻干燥保护剂的选择。通过单因素试验筛选出3种NK的有效冷冻保护剂,再经正交试验得到NK冻干保护剂的最佳配比组合为β-环糊精5%、麦芽糊精10%、辛烯基琥珀酸淀粉钠2%。在此条件下,NK活力保存率可达74.2%,明

3、枯草芽孢杆菌发酵产纳豆激酶的研究

纳豆激酶不但有很强的溶栓功能,且还有安全性能好,易被人体吸收,作用迅速,药效时间长,可由微生物直接发酵生产因而造价低廉等优点。本研究利用目标菌所具有的耐热性及显著的纤溶活性等生物学特性设计选育方案,从国内外的纳豆产品中分离出了1株纳豆激酶高产菌株—NT-6,并以此为出发菌株,通过盐酸羟胺和紫外线复合诱变处理,利福平抗性平板筛选和发酵筛选相结合的方法,获得了一株突变株—NU9012,其产酶能力比诱变前提高了68%,在未经优化的摇瓶发酵条件下,纳豆激酶的酶活力达到了648IU/mL。在单因素实验和正交试验的基础上,先用Plackett-Burman(PB)方法对影响菌株NU9012液体发酵诸因素的效应进行评价,并筛选出了有显著正效应的木糖浓度和显著负效应的接种量及K2HPO4浓度这3个因素,利用响应面分析法(R

4、纳豆固体发酵和纳豆激酶的催化特性

在纳豆固体发酵中，接种量为8%时，纳豆激酶的活性达到了972IU/g样品，比传统4％接种量提高了约64％。固体发酵24h，纳豆激酶活性达到709IU/g，培养时间延长酶活反而下降。发酵结束后，纳豆表面覆盖厚厚的白色粘物，能拉出很长的细丝。当豆子被切成2瓣时菌株在纳豆表面的生长最旺盛。纳豆固体发酵最佳条件为：大豆破碎2瓣、接种量为8%、发酵时间24h，纳豆激酶活力最高为976IU/g。用纤维蛋白平板法，比较了液体发酵和固体发酵的酶活力，液体发酵中纳豆激酶的酶活为142IU/mL，固体的最佳酶活为976IU/g。在纳豆芽孢杆菌BN-3菌株液体发酵中，发酵液的残糖量在最初16h以内是快速下降，从32mg/mL降至9mg/mL，说明此时菌株消耗糖迅速生长，在16h以后糖的消耗变化不大，说明菌株生长稳定，开始大量表达蛋白。纳豆

5、纳豆激酶（NK）分离纯化、生物活性

通过培养基-纤维蛋白平板法从购买和自己分离的纳豆菌中快速筛选出了一株高产酶的纳豆菌种,并用其作为纳豆种子菌的菌种,以蒸煮处理的大豆为培养基,通过固体浅盘发酵法制备得到纳豆。又改进了提取、分离、纯化工艺,以酸法提取(0.2M醋酸为缓冲液)和凝胶过滤(Sephadex G-25 凝胶柱)纯化得到了纳豆激酶酶制品。实验证明该酶制品不仅对纤维蛋白有很好的溶纤作用,而且对大鼠血纤维也有很好的溶栓作用,还证明该酶制品对大鼠新鲜血液有很好的抗凝性能。尤其重要的是,通过该工艺得到的酶制品在pH2.45并经胃蛋白酶处理后,仍保持高活力。通过SDS-PAGE凝胶电泳发现其中有5个大分子量的蛋白与该激酶共存,很可能是这些物质和纳豆激酶结合,屏蔽了纳豆激酶的水解位点,使纳豆激酶

6、纳豆激酶的发酵、纯化条件的优化及开发应用

研究了纳豆激酶的发酵、提纯和应用等方面，主要研究内容包括以下5个方面。1）纳豆的制备及其质量检测。通过对精选黄豆进行清洗、浸泡、沥水、蒸煮、冷却、接种、发酵、后熟等工艺制得纳豆，同时对其质量进行检测。检测结果表明，纳豆呈淡黄色，具有纳豆特有的滋气味，粘性强、拉丝状态好、豆粒软硬适宜，无肉眼可见杂质；纳豆含水量为57.4g/100g，氨基酸态氮（以氮计）为0.355g/100g，蛋白质为19.56g/100g。以上测定结果符合SB/T10528-2009《纳豆》对纳豆指标的各项要求。2）NK固体发酵条件的研究。首先对影响NK活力的食盐加入量、大豆初始含水量、大豆蒸煮时间、菌体接种量、发酵时间、发酵温度和后熟时间等7个固体发酵条件进行了单因素实验

7、纳豆激酶的分离纯化和酶学性质的研究

为了获得高纯度、高比活的纳豆激酶产品。我们以生产纳豆激酶的Bacillus subtilis 进行深层发酵得到的发酵液为原料,离心去除菌体,进行分离纯化。采用两种方法, 第一种方法:20%-60%饱和度硫酸铵沉淀,Superdex 75凝胶过滤层析和SP Sepharose Fast Flow离子交换层析对活性组分进行分离提纯,用纤维平版法测定活力,SDS-PAGE 对分离纯化的效果进行了检验,只观察到单一条带,最终纯化倍数和酶活回收率分别 为8. 4和49%。第二种方法:将发酵液装入截留分子量为6,000的透析袋中,置于纯 水中透析24小时。透析后的酶活回收率为83. 8%,纯化倍数为1. 05。将透析后的发 酵液上SP Sepharose Fast Flow离子交换柱进行梯度洗脱,流速为5mL/min,上样量为 15mL,最终的纯化倍数为2. 4,酶活回收率为

8、纳豆激酶分离、纯化及其酶学性质研究

研究开发新型溶栓制剂迫在眉睫。纳豆是一种日本传统的发酵食品，经研究含有大量的生物活性物质，具有抗栓、降血压、抗菌、预防癌症等多种生理功能，但发酵成熟的纳豆因其具有特殊的氨味而不被大多数人所接受。选取合适的发酵底物，优化发酵条件，开发新的产品是十分必要的。纳豆激酶是纳豆发酵过程中产生的一种高效血栓溶解酶，来源于传统的发酵食品，生产工艺相对简单，因为价格低廉，且溶栓性能良好，很有希望发展成为新一代溶栓药物。选取花生作为发酵底物，对纳豆花生发酵条件进行优化，研究粗酶液的抑菌性能以及对纳豆激酶进行分离纯化和酶学性质的研究，最终所得结果如下：1通过单因素试验及正交试验，确定纳豆花生最佳发酵条件为：蔗糖添加量2%，NaCl添加量1%,接种

9、纳豆激酶分离纯化工艺与缓释片剂的研究

以新一代溶栓物质纳豆激酶为模型药物，对纳豆激酶的分离纯化、酶学性质、缓释片的制备及其稳定性进行了系统研究。采用TAME法作为纳豆激酶活性的测定方法，操作简单、快速，在纳豆激酶的浓度范围为0.015-0.25mg/ml内线性关系良好，精密度较高，重现性好。对纳豆激酶的分离纯化进行了研究，纳豆激酶发酵液的粗提物经Superdex 75凝胶层析和PAGE电泳纯化，可得到纳豆激酶的纯品，经SDS-PAGE电泳检验为单一色带，分子量为28kDa。研究了纳豆激酶的酶学性质，在30℃以下，纳豆激酶的活性能较好地保持，当温度高于40℃时，酶活开始下降，表明温度对纳豆激酶的活性有显著影响；纳豆激酶的最适稳定pH为6-10，而在pH<4时，纳豆激酶很容易失活，表明纳豆激

10、纳豆激酶高产菌株筛选及发酵工艺优化研究

通过紫外线照射对该菌株实施诱变,根据纳豆芽孢杆菌致死曲线确定菌株的诱变照射时间。经多次诱变之后,得到产酶能力更高的菌株(暂命名YNS-1)。以筛选诱变后的高产菌株为出发菌株,对高产纳豆激酶发酵培养基组成及培养条件实施优化,优化后的发酵培养基成分及培养条件如下:发酵培养基的最佳氮源为发芽豆粉,添加量为8g/100mL;最佳碳源为葡萄糖,添加量为2%;MgSO4最佳添加量为0.05%;最适发酵温度为38℃;最适pH为7;发酵菌种培养24h接种,接种量为2%;采用摇瓶发酵时,摇床转速最佳值为150r/min,三角瓶的装液量为200mL/500mL,经过三天发酵,纳豆激酶的酶活力达到最大值。最后通过对比性实验,验证了经诱变后的菌株在优化发酵培养基中具有最高的酶活产量,酶活力可以达到846IU/

11、纳豆激酶固态发酵工艺及纳豆冻干粉制备的研究
12、纳豆激酶生产菌的筛选及其酶学性质研究
13、纳豆激酶微生物法制备工艺及溶栓作用的基础研究
14、纳豆激酶研究
15、纳豆加工工艺的研究和产品开发
16、纳豆菌发酵产纳豆激酶及与红曲菌共培养的初探
17、CN101979530A-一种适用于工业化生产的分离纯化纳豆激酶的方法-申请号2010102921309
18、CN101979531A-一种高产纳豆激酶液体发酵方法-申请号2010102921192
19、CN102041293A-纳豆激酶快速检测方法-申请号2009101976621
20、CN102071182A-一种新的纳豆激酶制备方法-申请号2009101546360
21、CN102220258A-一种产纳豆激酶枯草芽孢杆菌及该菌种发酵生产纳豆激酶的方法-申请号2011100998387
22、CN102406923A-三种能提高纳豆激酶活性的中药-申请号2010102921277
23、CN102406942A-一种制备纳豆激酶环糊精包合物的方法-申请号2010102879142
24、CN102465169A-一种用HPLC测定纳豆激酶纯度的方法-申请号2010105538455
25、CN102488071A-纳豆激酶冰激凌及其制作方法-申请号2011103907981
26、CN102586141A-一种纳豆激酶发酵菌剂的制备方法-申请号2012100276027
27、CN102599436A-高活性纳豆激酶及纳豆粉的制造方法-申请号201110027125X
28、CN102604917A-一种高纯度纳豆激酶的制备方法-申请号2012100974635
29、CN102618522A-一种采用鹰嘴豆工业化生产纳豆激酶的方法-申请号2011100346542
30、CN102943060A-高活热稳定性纳豆激酶菌株及其发酵制品-申请号2012104793821
31、CN103205409A-一种以黑豆为原料制备高活性纳豆激酶的方法-申请号2013101544022
32、CN103238829A-一种纳豆激酶肠溶胶囊及其制备方法-申请号2012100315163
33、CN103255156A-位点突变的高活热稳定性纳豆激酶基因及其应用-申请号2013102111343
34、CN103385461A-以蚕豆为原料制备高活性纳豆激酶发酵物的方法-申请号2012101407497
35、CN103387970A-一种纳豆菌发酵鹰嘴豆粉产纳豆激酶的方法-申请号2012101407482
36、CN103409355A-一种利用菜籽粕产纳豆激酶的纳豆芽孢杆菌及其应用-申请号2013103804429
37、CN103583690A-富含纳豆激酶的乳制品及其制作方法-申请号2013105968090
38、CN103589706A-纳豆激酶的提纯方法及制备方法-申请号201310149128X
39、CN103602651A-一种纳豆激酶生产方法-申请号2013105479713
40、CN103695359A-一种产纳豆激酶枯草芽孢杆菌菌株及其应用-申请号2014100091975
41、CN103734627A-一种富含纳豆激酶的风味纳豆的制备方法-申请号2014100092874
42、CN103766781A-一种富含纳豆激酶和MonaclinK的豆豉的制备方法-申请号2014100093218
43、CN103849610A-纳豆激酶的制造方法-申请号2012105123738
44、CN103923896A-一种纳豆激酶高效表达的方法及其用途-申请号2014100688331
45、CN103937830A-一种高效分泌表达纳豆激酶的重组菌-申请号2014101099527
46、CN103948915A-一种能够提高稳定性和口服疗效的用于预防血栓形成和溶栓的纳豆激酶组合物-申请号2014101868789
47、CN103977397A-一种纳豆激酶口服乳剂及其制备方法-申请号2014101984900
48、CN104152429A-纳豆激酶高产枯草芽孢杆菌株的筛选及液态发酵的方法-申请号2013101785616
49、CN104187446A-一种富含纳豆激酶的天贝的制备方法-申请号2014104321849
50、CN104366304A-一种含有纳豆激酶和益生菌的微胶囊及其制备方法和应用-申请号2014106184367
51、CN104381465A-一种富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的红芸豆乳的制备方法-申请号2014107528992
52、CN104381932A-一种富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的白菜泡菜的制作方法-申请号2014107517447
53、CN104397196A-一种富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的酸豆乳的制备方法-申请号2014107517822
54、CN104430853A-选育纳豆芽孢杆菌与干酪乳杆菌共发酵制备富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的发酵羊乳的方法-申请号2014107514805
55、CN104430910A-一种富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的鹰嘴豆乳的制备方法-申请号201410751322X
56、CN104430911A-一种富含吡咯喹啉醌和纳豆激酶的黑豆乳的制备方法-申请号2014107514241
57、CN104431874A-一种富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的食疗发酵马铃薯汁的制备方法-申请号201410751273X
58、CN104432324A-富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的食疗发酵魔芋汁的制备方法-申请号2014107512087
59、CN104432351A-一种富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的发酵蓝莓汁的制作方法-申请号2014107510734
60、CN104432358A-一种富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的发酵柚子汁的制作方法-申请号2014107511277
61、CN104432378A-选育纳豆芽孢杆菌与干酪乳杆菌共发酵制备富含吡咯喹啉醌和纳豆激酶的薏米汁的方法-申请号2014107511629
62、CN104432379A-富含吡咯喹啉醌和纳豆激酶的食疗发酵紫米汁的制备方法-申请号2014107513662
63、CN104472685A-选育纳豆芽孢杆菌与干酪乳杆菌共发酵制备富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的酸奶的方法-申请号2014107539268
64、CN104473111A-富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的西兰花泡菜的制作方法-申请号2014107510132
65、CN104489129A-纳豆激酶型腐乳及其制备方法-申请号2014108274921
66、CN104522769A-富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的发酵哈密瓜汁的制作方法-申请号2014107507816
67、CN104522771A-富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的发酵猕猴桃汁的制作方法-申请号2014107510664
68、CN104522773A-一种富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的发酵芒果汁的制作方法-申请号2014107516228
69、CN104522774A-富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的食疗发酵甘薯汁的制备方法-申请号201410752774X
70、CN104522789A-选育纳豆芽孢杆菌与干酪乳杆菌共发酵制备富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的玉米汁的方法-申请号2014107510147
71、CN104522795A-一种富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的糯米汁的制备方法-申请号2014107528371
72、CN104531833A-一种纳豆激酶活性测定方法-申请号2014107895690
73、CN104630124A-一株产纳豆激酶的地衣芽胞杆菌工程菌和用该菌生产纳豆激酶的方法-申请号2013105623663
74、CN104689307A-纳豆激酶在制备抗老化与改善学习记忆能力的药物中的用途-申请号2014100242104
75、CN104970364A-一种具有高纳豆激酶保留量的纳豆粉微胶囊的制备方法-申请号2015104264605
76、CN105011240A-一种发酵法生产富含纳豆激酶的核桃粉和核桃风味酱方法-申请号2015103792308
77、CN105053227A-一种以全豆制备富含纳豆激酶的风味型酸豆乳的方法-申请号2015105599818
78、CN105087447A-一株耐微波枯草芽孢杆菌及其在纳豆激酶制备中的应用-申请号201510588951X
79、CN105087539A-纳豆激酶微胶囊的制备方法-申请号2015105997497
80、CN105145815A-一种含纳豆激酶的保健调和奶饮品及其制备方法-申请号2015104529767
81、CN105274078A-一种采用深层液体发酵提取纳豆激酶的方法-申请号2015107317040
82、CN105368762A-一株可以高效分泌纳豆激酶的地衣芽胞杆菌工程菌-申请号2014104174430
83、CN105505931A-一种强启动子及其在提高纳豆激酶表达的应用-申请号2016100042395
84、CN105586329A-一种可放大的快速高效纳豆激酶纯化制备方法-申请号2015104950629
85、CN105707234A-一种含高活性纳豆激酶发酵乳的制备方法-申请号2016100755320
86、CN105725082A-一种富含纳豆激酶的纳豆冻干粉的制备方法-申请号2016100879817
87、CN105755045A-一种输卵管纳豆激酶慢病毒表达载体、构建方法及用途-申请号2016100560110
88、CN105779422A-一种高产纳豆激酶的液态发酵培养基-申请号201410809405X
89、CN105903004A-溶解血栓的纳豆激酶组合物及其制备方法-申请号2016104815405
90、CN105941620A-一种富含纳豆激酶的芦荟脱脂复原乳酸奶及其制备方法-申请号2016102937342
91、CN105941621A-一种富含纳豆激酶的芦荟全脂酸奶及其制备方法-申请号2016102939009
92、CN105944091A-抗血栓的纳豆激酶组合物及其制备方法-申请号2016104815960
93、CN105963690A-用于溶栓的纳豆激酶组合物及其制备方法-申请号2016104868830
94、CN105981807A-含纳豆激酶的奶制品-申请号2015100988453
95、CN106039295A-一种用于预防血栓形成和溶栓的纳豆激酶组合物及其制备方法-申请号2016104822413
96、CN106039296A-纳豆激酶组合物及其制备方法-申请号2016104869053
97、CN106085934A-食品级纳豆激酶表达菌-申请号2016104108118
98、CN106085991A-一种固态发酵制备纳豆激酶的方法-申请号2016105623313
99、CN106118861A-一种纳豆激酶协同降血脂的山茶油及其制备方法-申请号2016106577717
100、CN106310243A-一种纳豆激酶胶囊及其制备方法-申请号201610896255X
101、CN106668844A-一种纳豆激酶微胶囊及其制备方法-申请号2016108527572
102、CN106701719A-利用纳豆芽孢杆菌发酵联产维生素K2和纳豆激酶的方法-申请号2017100290031
103、CN106755017A-一种纳豆激酶的转基因方法-申请号2017100147207
104、CN106987577A-一种液态发酵法制备纳豆激酶的方法-申请号2017103982119
105、CN106993735A-一种龙香芋纳豆激酶饮品及其制备方法-申请号2017102311530
106、CN106995810A-一种固态发酵法制备纳豆激酶的方法-申请号2017103975844
107、CN107058188A-一种纳豆激酶高产菌株的筛选方法-申请号2017103981991
108、CN107058204A-一株可以高效分泌纳豆激酶的枯草芽孢杆菌株及高纯纳豆激酶制备工艺-申请号2017102215675
109、CN107099487A-一种高分泌纳豆激酶的枯草芽孢杆菌及其应用-申请号2017104986225
110、CN107129944A-一种产纳豆激酶贝莱斯芽孢杆菌菌株及其应用-申请号2017102794377
111、CN107129977A-一种生产纳豆激酶的培养基及其制备方法和用途与用法-申请号2017103978359
112、CN107254422A-一种提高纳豆激酶产生菌稳定性与纳豆激酶活性的培养基-申请号2017105320989
113、CN107254423A-一种纳豆激酶菌剂的制备及使用方法-申请号2017105320993
114、CN107354141A-一种改性纳豆激酶及其应用-申请号2017108100618
115、CN107375913A-一种负载纳豆激酶的血栓通络药物及其制备方法-申请号2017108100552
116、CN107412750A-含高活性纳豆激酶的组合物及其制备方法-申请号2017102299045
117、CN107412751A-纳豆激酶组合物及其制备方法-申请号201710229905X
118、CN107412753A-一种含纳豆激酶的控释片保健品及其制备方法-申请号2017106723493
119、CN107475230A-含有芝麻、百合、山药成分的高产纳豆激酶液态培养基-申请号2017108301424
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126、CN107828686A-一种高产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌亚种及其应用-申请号2017111307356
127、CN107841473A-一种高产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌及其应用-申请号2017111308081
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